Ученые разработали новый метод определения устойчивости к фунгицидам, позволяющий им выявлять множественные мутации, как известные, так и новые, всего за один тест. Сначала исследователи сосредоточились на защите зерновых культур.
Фунгициды - важнейшие агрохимические продукты для борьбы с болезнями сельскохозяйственных культур, из них фунгициды с использованием ингибиторов деметилазы или азольные фунгициды широко применяемы в защите растений.
Азолы являются системными фунгицидами с одним сайтом действия, которые нацелены на фермент цитохрома P450 стерол 14α-деметилазу (CYP51), который играет важную роль в биосинтезе грибного стерола эргостерола. Азольные фунгициды нарушают функцию CYP51 и, следовательно, стабильность и текучесть мембраны за счет комбинации истощения эргостерола и накопления токсичных промежуточных стеролов.
Азольные фунгициды высокоэффективны, и развитие резистентности, как правило, происходит медленнее, чем у других односайтовых фунгицидов. Однако все равно растет число случаев резистентности к азолам, которое было зарегистрировано среди экономически важных патогенов сельскохозяйственных культур, таких как Zymoseptoria tritici, вызывающий септориоз листьев пшеницы, Fusarium graminearum (фузариум злаковый) и некоторых других.
Существует три основных механизма резистентности к азольным фунгицидам: мутации в гене Cyp51 , которые изменяют связывание фунгицида, сверхэкспрессия Cyp51 из- за модификаций промотора и повышенный отток из клетки. Эти механизмы не являются взаимоисключающими, и несколько из них могут существовать в одном и том же изоляте, увеличивая уровни резистентности. Еще одним осложнением является существование более одного паралогичного гена Cyp51 у нитчатых аскомицетов, включая множество фитопатогенов. Однако у аскомицетов с более чем одним паралогом Cyp51 мутации, связанные с устойчивостью к фунгицидам, связаны в основном с Cyp51A.
Патогены P. teres f. teres (Ptt) и P. teres f. maculata (Ptm) являются возбудителями сетчатой формы сетчатой пятнистости и точечной формы сетчатой пятнистости ячменя соответственно. Ptt содержит один ген Cyp51B и две копии Cyp51A: Cyp51A1 и Cyp51A2, при этом мутация устойчивости к фунгицидам F489L встречается только в Cyp51A1 10 и на сегодняшний день мутации, связанные с устойчивостью к фунгицидам, в Cyp51B не обнаружены . В отличие от Ptt, Ptm содержит только одну копию Cyp51A , но мутации промотора и кодирующей последовательности связаны с устойчивостью к азольным фунгицидам.
Ptt и Ptm также могут образовывать гибриды в природе с одним гибридным гаплотипом, демонстрирующим высокий уровень устойчивости к азольным фунгицидам, предположительно, приобретшим этот признак в результате естественной рекомбинации между двумя формам
Выявление и мониторинг устойчивости к фунгицидам как в сельском хозяйстве, так и в клиниках человеческой медицины, имеет решающее значение для мониторинга устойчивых популяций и информирования о соответствующем управлении.
Например, если обнаружена устойчивость к азольному соединению, можно скорректировать химическое управление, чтобы избежать чрезмерного селективного давления на популяцию патогена, а затем популяцию можно тщательно контролировать, чтобы гарантировать эффективность изменения обработки.
Для этого требуются быстрые, точные и доступные по месту технологии молекулярного обнаружения, способные улавливать сложную сеть как известных, так и развивающихся генетических мутаций, вызывающих устойчивость. Несколько аллель-специфических технологий, таких как петлевая изотермическая амплификация, цифровая ПЦР и количественная ПЦР (кПЦР), были развернуты для выявления и мониторинга устойчивости к фунгицидам у фитопатогенов.
Несмотря на свою полезность, эти технологии страдают от двух основных ограничений: необходимость отдельного анализа для каждой мутации и невозможность обнаружения новых мутаций. В Ptm есть несколько различных вставок промотора и мутаций кодирующей последовательности, которые могут существовать отдельно или в комбинации. Ptm и Ptt также тесно связаны и могут образовывать гибриды, что еще больше усложняет диагностику устойчивости. Таким образом, скрининг на устойчивость полевых образцов становится сложным и трудоемким процессом, включающим большой массив анализов.
Благодаря совместным инвестициям Университета Кертина и австралийской Корпорации по исследованиям и разработкам в области зерна (GRDC) исследователи из Центра по борьбе с болезнями и урожайностью (CCDM), Австралия, смогли быстро и точно обнаружить мутации устойчивости к фунгицидам с помощью портативного устройства для секвенирования ДНК MinION от компании Oxford Nanopore Technologies, Великобритания, включая неизвестные мутации, которые невозможно обнаружить традиционными методами.
Исследователь CCDM и ведущий автор доктор Кэтрин Зулак отметила, что традиционные методы выявления мутаций внутри патогенов часто требуют больших трудозатрат и времени и ограничиваются скринингом только ранее известных мутаций.
«Сетчатая пятнистость ячменя имеет две формы: точечную и сетчатую, каждая из которых имеет свой собственный набор различных мутаций. Более того, конкретный целевой ген, который мы изучали, может иметь мутации, происходящие в двух разных регионах, каждый из которых, опять же, имеет свой собственный набор мутаций. Таким образом, каждый раз, когда нам нужно было исследовать образец на устойчивость к фунгицидам, раньше нам приходилось проводить тесты на каждую из этих возможных мутаций. Чтобы упростить этот все более сложный процесс, мы использовали Nanopore MinION для секвенирования целевых генов фунгицидов и предоставления полной карты всех возможных мутаций, которые могут включать те, которые мы ранее не идентифицировали. Например, при разработке этого метода мы обнаружили недавно обнаруженную вариацию известной мутации. Это тот тип мутации, который мог бы остаться незамеченным при использовании традиционных методов. Область устойчивости к фунгицидам постоянно меняется, и эта технология упрощает наш процесс выявления устойчивости к фунгицидам и обеспечивает нам возможность обнаруживать новые мутации по мере их появления, что позволяет нам эффективнее решать эту проблему по мере ее развития», поясняет исследователь.
Рабочий процесс культивирования, амплификации, секвенирования и биоинформатического анализа мицелия, культивируемого на среде с добавлением тебуконазола из образцов инфицированных листьев. Источник: Scientific Reports (2024). DOI: 10.1038/s41598-024-56801-z.
«Поскольку мы секвенируем области в геноме патогена, мы не только собираем данные для текущих исследований, но и создаем ресурс для будущих исследований. Эта генетическая информация может храниться в национальных базах данных, предоставляя ориентир для исследователей в последующих проектах и гарантируя, что будущие усилия будут основываться на наших существующих знаниях», - говорит доктор Зулак.
Профессор Марк Гибберд, директор CCDM, подчеркнул приверженность центра поиску новых инструментов и ресурсов, которые могут ускорить и расширить возможности отрасли по борьбе с этой проблемой.
«Инновации лежат в основе нашего исследовательского центра, и этот проект является прекрасным примером нашей способности черпать вдохновение из самых разных областей для борьбы с наиболее серьезными проблемами заболеваний в зерновой отрасли», —-сказал профессор Гибберд.
«Инвестиции в исследования в Австралии составляют лишь малую часть мировых инвестиций в исследования. Благодаря международному партнерству, совместным инвестициям и сотрудничеству CCDM мы смогли использовать результаты глобальных НИОКР для внедрения инноваций и решений мирового уровня на благо австралийского сельского хозяйства», - заключил он.
Источник: Grains Research and Development Corporation. На фото: научный сотрудник CCDM Лина Фарфан Касерес и научный сотрудник д-р Кэтрин Зулак в лаборатории с MinION от Oxford Nanopore Technologies. Фото: CCDM.