Команда исследователей из Техасского университета A&M AgriLife Research, Мэрилендского университета и Министерства сельского хозяйства США (USDA) представила инновационную технологию CRISPR-Combo. Метод позволяет одновременно редактировать целевые гены и активировать внутренние ростовые механизмы растений. Это открытие способно сократить путь новых сортов из лаборатории на фермерские поля с десятилетий до нескольких лет. Результаты исследования опубликованы в журнале Nature Communications.
До сих пор главным тормозом в растительной биоинженерии было не само редактирование ДНК, а регенерация. Ученые могут успешно изменить ген в отдельной клетке, но заставить ее вырасти в полноценное растение сложно. Особенно тяжело этот процесс протекает у многолетних культур — цитрусовых, картофеля, тополя или дикой земляники. В чашках Петри их клетки часто отказываются делиться, из-за чего перспективные лабораторные разработки годами не могли дойти до коммерческого использования.
Классические методы стимуляции роста целого растения из клетки требуют внедрения чужеродных генов (трансгенов), которые впоследствии тяжело удалить из ДНК.
Когда ученые редактируют ДНК, они делают это в изолированных клетках или кусочках ткани (эксплантах). Чтобы эти измененные клетки не погибли, а превратились в полноценные саженцы с побегами и корнями, их нужно заставить экстренно делиться и расти. Этот важный процесс называется регенерацией.
До появления CRISPR-Combo биотехнологи использовали два основных классических подхода, чтобы заставить отредактированную клетку расти.
Первый, это гормональный метод, который представляет собой добавление внешних фитогормонов. Клетки в чашках Петри заливают искусственными растительными гормонами (ауксинами и цитокининами). Проблема в том, что для каждого растения дозировку нужно подбирать долго и тщательно. Если гормонов будет переизбыток, то вместо растения вырастет бесформенная опухолевая масса (каллус), а при недостатке клетка погибнет. Многие многолетние растения (цитрусовые, тополь) вообще слабо реагируют на внешние гормоны.
Второй, подразумевает трансгенный метод, то есть внедрение чужеродных генов роста. Чтобы «включить» внутренние механизмы деления, ученые берут специальные гены-стимуляторы из совершенно других организмов (например, бактериальные гены или ДНК других видов растений) и встраивают их в геном клетки. Эти гены начинают непрерывно вырабатывать нужные для роста белки. Но когда растение начинает регенерировать, оно становится трансгенным (ГМО). Чужеродный «ген роста» выполнил свою задачу, но остался внутри ДНК. Если его там оставить, взрослое дерево вырастет уродливым или бесплодным из-за постоянной аномальной стимуляции.
В классической генной инженерии, чтобы удалить ставший ненужным «чужой» ген роста, ученым приходится использовать метод гибридизации (скрещивания). Отредактированное растение скрещивают с обычным, надеясь, что в следующем поколении потомства чужеродный фрагмент ДНК отсеется естественным путем. Для кукурузы или салата это не проблема. Но для многолетних культур, чтобы тополь или апельсиновое дерево дали первые семена для скрещивания, должны пройти годы. К тому же при скрещивании перемешивается весь остальной геном, и уникальный элитный сорт (например, особый сорт сладкого апельсина) просто теряет свои исходные вкусовые и товарные качества
CRISPR-Combo решает эту задачу. Один и тот же инструмент CRISPR одновременно вырезает или заменяет нужный ген (например, отвечающий за устойчивость к засухе) и запускает «команду роста». Система не добавляет стороннюю ДНК, а активирует собственные «морфогенетические» гены растения там, где они уже заложены природой. Эти внутренние гены заставляют клетку активно делиться и самостоятельно формировать здоровые корни, побеги и полноценный организм.
«Регенерация — одно из главных препятствий на пути от многообещающего редактирования генов в лаборатории до создания сорта сельскохозяйственной культуры, действительно полезного для фермеров. Наша работа показывает, что мы можем заставить собственные гены растения регенерировать быстрее и надежнее», — отмечает Кранти Мандади (Kranthi Mandadi). Он является профессором кафедры фитопатологии и микробиологии Техасского университета A&M, а также возглавляет Научно-исследовательский центр Texas A&M AgriLife в Уэслако.
Метод эффективен для многолетних культур (картофель, цитрусовые, дикая земляника, тополь), которые трудно поддаются селекции. Система позволяет селекционерам в один шаг улучшить признак (например, устойчивость к засухе или болезням) и тут же запустить ускоренное деление клеток для получения готового растения.
Стоит отметить, что биологически картофель является многолетним растением, хотя в сельском хозяйстве мы привыкли воспринимать и выращивать его как однолетнюю культуру. Если оставить картофель в земле и не выкапывать на зиму (в условиях мягкого климата, где почва не промерзает), его клубни перезимуют, а весной из глазков вырастут новые побеги. Куст продолжит свой жизненный цикл, используя накопленные в клубнях питательные вещества. Ученые классифицируют его именно по биологическому виду — Solanum tuberosum (многолетнее травянистое клубненосное растение).
Как и древесные многолетники (цитрусовые или тополь), картофель крайне неохотно регенерирует из отдельных клеток в полноценные саженцы на питательных средах. Он обладает высокой «неподатливостью» к культивированию in vitro (в пробирке), поэтому система CRISPR-Combo для него так же важна, как и для деревьев.
Также не стоит путать меристемное выращивание картофеля, что тоже начинается в пробирке, и геномное редактирование. Между обычным меристемным размножением и генетическим редактированием клеток есть биологическая разница.
В меристеме (от греческого meristos — делимый). Так в ботанике называют образовательную ткань растений, клетки которой способны активно делиться и давать начало всем остальным тканям и органам) ученые берут готовую, уже сформированную микроскопическую почку (меристему) из ростка картофеля. В ней уже есть зачатки листьев и стебля. Клеткам не нужно перестраиваться — они просто продолжают делиться и расти по заранее заложенной природой программе. С этим картофель справляется отлично.
В геномном редактировании, чтобы изменить ДНК с помощью CRISPR, ученые не могут работать с целой почкой. Им приходится разделять ткань на отдельные изолированные клетки или снимать с них клеточную стенку (получая протопласты). После того как в одну такую клетку внесли изменения, происходит генетический «шок». Клетку нужно заставить полностью забыть свое прошлое, превратиться в эмбриональную и с чистого листа построить органы растения (корень, побег).
Вот этот переход от одиночной отредактированной клетки до целого растения у картофеля идет крайне проблематично. Ткани часто начинают бесконтрольно разрастаться в каллус, который стареет и погибает, так и не дав ростков.
Новая система как раз и превращает «капризную» одиночную отредактированную клетку картофеля в подобие той самой активной меристемной почки. Она принудительно включает внутри клетки естественные сигналы: «Пора формировать побег!». В результате ученые получают и точное редактирование генома, и высокую скорость роста, которой раньше мешал генетический барьер.
