Исследователи из Университета Иллинойса в Урбана-Шампейне расширили набор инструментов для изучения небольших регуляторных элементов, называемых вышележащими открытыми рамками считывания (uORF). Новый метод анализа транзиентной экспрессии, разработанный исследователями в качестве скринингового инструмента, использует флуоресцентные белковые репортеры, связанные с uORF, для быстрого анализа того, как изменения в последовательностях uORF влияют на регуляцию генов in vivo. Работа опубликована в журнале Plant Direct.
uORF — это элементы ДНК-последовательности, которые помогают регулировать трансляцию матричной РНК (мРНК) в белки. Поскольку uORF широко распространены в геномах растений, они представляют собой мощную мишень для исследователей в целях контроля экспрессии генов. Предыдущие исследования показали, что uORF часто снижают количество белка, продуцируемого из молекулы мРНК. Когда последовательности ДНК uORF удаляются или изменяются с помощью методов редактирования генов, таких как CRISPR-Cas9, этот ингибирующий эффект может быть снят, что приводит к увеличению производства белков из определенных генов.
Существующие методы изучения uORF обычно заключаются в присоединении этих регуляторных элементов к так называемым репортерным генам и временном введении их в модельные растения или специализированные клеточные системы для оценки.
Одним из часто используемых репортеров является люцифераза — фермент, ответственный за свечение светлячков, который производит измеримый световой сигнал во время химических реакций. Однако эти подходы часто требуют дополнительной подготовки образцов и специализированных реагентов, особенно в экспериментально сложных системах, таких как протопласты — растительные клетки с удаленными клеточными стенками.
Более простой способ считывания показаний в листьях
Этот метод, разработанный командой из Иллинойсского университета в Урбане-Шампейне, направлен на упрощение процесса за счет использования неповрежденной листовой ткани и флуоресцентных белков, что позволяет быстро анализировать регуляцию генов, опосредованную uORF, одновременно сокращая объем работы с образцами и расходные материалы.
Разработка этого метода была инициирована Беном Хаасом в рамках работы лаборатории Стивена Лонга над проектом Realizing Increased Photosynthetic Efficiency (RIPE).
RIPE — это крупный международный научно-исследовательский проект, направленный на повышение урожайности продовольственных культур путем генетического улучшения фотосинтеза.
«Главная цель RIPE — модификация фотосинтеза в интересах сельского хозяйства и мелких фермеров. Многие исследователи RIPE стремятся модулировать генные продукты в этом процессе, — сказал Хаас. — И редактирование генов может стать очень мощным инструментом для достижения этой цели в различных видах сельскохозяйственных культур».
Как проводится сравнение результатов анализа
Метод работает за счет связывания природных или модифицированных uORF с флуоресцентными репортерными белками, которые испускают измеримые световые сигналы в тканях листьев растений. Затем исследователи временно вводят эти генетические конструкции в листья с помощью Agrobacterium, бактерии, широко используемой в биотехнологии растений для переноса ДНК в растения. Через несколько дней флуоресцентные сигналы можно измерить с помощью стандартного лабораторного прибора. Сравнивая уровни флуоресценции между природными и модифицированными uORF, исследователи могут определить, влияют ли изменения в регуляторных элементах на экспрессию генов.
«Мы сравниваем сигнал от исходной последовательности с сигналом от модифицированной версии, — сказал Хаас. — Если флуоресценция значительно изменяется, это указывает на то, что uORF влияет на экспрессию гена».
Хотя флуоресцентные белки давно используются в качестве репортеров в молекулярной биологии, их применение для изучения опосредованной uORF регуляции генов в растениях появилось сравнительно недавно. Измерение флуоресценции непосредственно в неповрежденной листовой ткани позволяет избежать значительной части дополнительной подготовки образцов, необходимой для многих современных анализов uORF.
Используя этот метод, исследователи проанализировали последовательности генов сои и вигны — двух культур, находящихся в центре проекта RIPE. Авторы идентифицировали uORF для генов, участвующих в фотозащите растений, и наблюдали за результирующими изменениями интенсивности флуоресценции.
Команда надеется, что этот инструмент окажется полезным для других исследователей, и разместила описанную в исследовании репортерную плазмиду в Addgene, где она доступна для публичного заказа.
«Этот инструмент может быть полезен любому исследователю растений, заинтересованному в измерении трансляционной силы лидерного участка транскрипта; он не обязательно должен ограничиваться только uORF. Исследователи могут ввести свои собственные последовательности и получить первые результаты уже через месяц», — сказал Хаас.
Источник: University of Illinois at Urbana-Champaign.
На фото: Nicotiana benthamiana использована в качестве модельного вида для тестирования этого метода. Автор фото: Бен Хаас.
