В релизе исследователи из Института Пибрайта объяснили, как они использовали методику на основе CRISPR для модификации генома мокрецов Culicoides.
Метод включает в себя введение смеси фермента Cas9 и молекул гидовой РНК (гРНК) самкам насекомых. Эти компоненты поглощаются их ооцитами (яйцеклетками), где они действуют подобно молекулярным ножницам, разрезая ДНК в строго определенных целевых участках и вызывая мутации.
Ведущий автор исследования Кэтрин Невард (ученый Научно-технологической платформы трансгенеза насекомых в Институте Пибрайта) пояснила, что «из-за размера и хрупкости яиц Culicoides первоначальные попытки провести редактирование генов у этого вида с использованием традиционных методов микроинъекций в эмбрионы оказались безуспешными».
В начале 2024 года Кэтрин провела два месяца в лаборатории профессора Джейсона Расгона (Университет штата Пенсильвания, США), эксперта в области генетики переносчиков болезней и пионера технологий, которые команда стремилась применить к мокрецам Culicoides. За это время она прошла обучение методам внутригрудных (интраторакальных) инъекций с использованием метода ReMOT Control. По возвращении Кэтрин команда применила внутригрудную инъекцию для внедрения недавно разработанного метода DIPA-CRISPR и успешно мутировала ген, отвечающий за цвет глаз у мокрецов, тем самым доказав, что этот метод работает на виде Culicoides.
Проще говоря, ученые обошли главную проблему, о которой говорилось ранее — хрупкость яиц. Вместо того чтобы пытаться под микроскопом проткнуть микроскопическое яйцо (что его разрушало), они ввели раствор CRISPR прямо в грудь взрослой самки (метод DIPA-CRISPR). Организм самки сам доставил «молекулярные ножницы» в формирующиеся яйцеклетки. В качестве теста они отключили ген цвета глаз — вылупившиеся мошки-мутанты имели другой цвет глаз, что доказало: технология работает и теперь можно отключать гены, отвечающие за перенос вирусов.
Доктор Рафаэль Хомем, возглавляющий Научно-технологическую платформу трансгенеза насекомых в Институте Пибрайта, подчеркнул, что «это первая демонстрация редактирования генов на основе CRISPR у любого вида Culicoides, и она дает практический подход к генетическим манипуляциям с этими насекомыми».
Доктор Кристофер Сандерс, руководитель отдела энтомологии в Пибрайте, добавил: «Эти инструменты позволят проводить новые исследования и поддержат усилия по лучшему пониманию болезней, переносимых мокрецами. Мокрецы Culicoides переносят болезни, поражающие скот и, в некоторых случаях, людей. Улучшение нашего понимания их биологии может помочь снизить передачу болезней и улучшить здоровье как животных, так и людей».
Институт Пибрайта получает основное финансирование через UKRI BBSRC (Исследовательский совет по биотехнологиям и биологическим наукам Великобритании) и активно сотрудничает с британскими и международными учеными.
Команда надеется, что этот метод будет взят на вооружение другими исследователями для изучения функций генов у Culicoides, что в конечном итоге будет способствовать лучшему пониманию и более эффективному контролю заболеваний, переносимых мокрецами.
Источник: The Pirbright Institute.
