Исследователи под руководством профессора Гао Цайся из Института генетики и биологии развития (IGDB) Китайской академии наук (CAS) и профессора Цю Цзиньлуна из Института микробиологии CAS разработали новую систему, которая обеспечивает быструю и масштабируемую направленную эволюцию разнообразных генов непосредственно в растительных клетках.
Об этой новой платформе, получившей название Geminivirus Replicon-Assisted in Planta Directed Evolution (GRAPE), сообщается в журнале Science и в релизе Китайской академии наук.
Современное сельскохозяйственное производство требует обильных генетических ресурсов. Направленная эволюция позволяет быстро генерировать генетические варианты с новыми и улучшенными свойствами. Однако эффективные платформы для проведения такой эволюции непосредственно в растительных клетках отсутствуют.
Ключевой проблемой является медленная скорость деления клеток у растений, что ограничивает скорость циклов отбора и обогащения функциональных вариантов.
Чтобы решить эту проблему, исследователи использовали геминивирусы — растительные ДНК-вирусы, которые быстро реплицируют ДНК в растительных клетках с помощью репликации по типу катящегося кольца (rolling circle replication (RCR)) — быстрого способа копирования кольцевой ДНК.
В частности, они связали репликацию репликонов искусственных геминивирусов (кольцевой ДНК, способной реплицироваться посредством RCR) с целевыми функциями вариантов генов в растительных клетках. Варианты, обладающие целевой функцией, побуждали репликон к репликации, создавая новые копии ДНК, тем самым избирательно амплифицируя эти варианты.
Основываясь на этом подходе, исследователи разработали платформу GRAPE. В этой платформе гены интереса (GOI) сначала подверглись мутагенезу in vitro, а полученные варианты были вставлены в репликоны искусственных геминивирусов. Эти библиотеки репликонов затем были доставлены в листья модельного растения Nicotiana benthamiana, где активность желаемого гена была связана с репликацией вируса.
Варианты, способствующие репликации, обогащались, а варианты, ингибирующие репликацию, истощались. Полный цикл отбора мог быть завершён на одном листе за четыре дня.
Используя GRAPE, исследователи разработали нуклеотидсвязывающий домен иммунного рецептора NRC3, содержащий богатые лейцином повторы (Nucleotide-Binding Domain Leucine-Rich Repeat-Containing, NLR), чтобы избежать ингибирования эффектором нематод SPRYSEC15 и при этом сохранить его иммунную активность.
Итеративная эволюция иммунного рецептора NLR риса Pikm-1 привела к появлению вариантов, реагирующих на шесть аллелей эффектора AVR-Pik у патогенного гриба, вызывающего так называемый ожог риса, Magnaporthe oryzae, что значительно расширило его спектр распознавания. Таким образом, стратегия позволяет создавать ценные генетические ресурсы для селекции устойчивых к болезням культур.
По сравнению с предыдущими системами на основе микроорганизмов, GRAPE предлагает явные преимущества: она превосходно справляется с разработкой целевых объектов, отвечающих за специфичные для растений фенотипы (например, устойчивость к болезням) или требующих специфичной для растений регуляции.
Более того, система работает непосредственно внутри растительных клеток, устраняя необходимость в повторной оптимизации. Платформа GRAPE потенциально способна эволюционировать любой ген, функционально связанный с RCR. Помимо биологии растений, GRAPE также перспективна для более широкого применения, например, для разработки протеаз для расщепления специфических мишеней в исследованиях растений и фармацевтики.
В заключение, GRAPE предоставляет собой быструю, эффективную и универсальную платформу, которая может ускорить развитие синтетической биологии растений и молекулярной селекции, открывая новые возможности для инженерии сельскохозяйственных культур и повышая устойчивость сельского хозяйства.
Источник: Chinese Academy of Sciences.
На заглавном фото вы видите графическое представление платформы GRAPE и ее приложений. Автор: Гао Цайся.
