Одной из главных целей современной селекции сельскохозяйственных культур является эффективное сочетание множества желаемых признаков путем «наслаивания» благоприятных вариантов генов (аллелей), которые способствуют этим признакам, в одном сорте культуры. Однако существующие стратегии постройки этой пирамиды генов часто отнимают много времени и не всегда неэффективны. Теперь разработана универсальная платформа для одновременного применения нескольких характеристик при создании сортов.
Группа исследователей под руководством Гао Цайся из Института генетики и биологии развития Китайской академии наук разработала платформу генной инженерии, которая позволяет сочетать множество признаков в сельскохозяйственных культурах путем объединения нокаута генов, точного редактирования последовательности и хромосомной инженерии в рамках единой системы. Результаты исследования опубликованы в журнале Nature Biotechnology.
Исследователи сначала разработали систему нокаута на основе двойного прайм-редактирования (gene knockout tool called twinPE-mediated gene knockout, TKO), которая устанавливает кластеры стоп-кодонов (SCC) для точного завершения трансляции с минимальным количеством внутрирамочных мутаций.
Это точный и эффективный инструмент для нокаута генов с помощью двойного прайм-редактирования, который точно вставляет небольшой фрагмент, содержащий кластер стоп-кодонов, в целевое место. TKO обеспечивает предсказуемое нарушение гена за счет точной установки стоп-кодонов, избегая вставок или удалений в рамке считывания, вызванных вставками или делециями, кратными трем нуклеотидам, которые часто наблюдаются в системах Cas9.
В протопластах TKO продемонстрировал эффективные возможности нокаута генов в однодольных культурах, таких как рис, пшеница и кукуруза. В регенерированных растениях риса средняя эффективность нокаута одного гена достигла 96,8%.
Для исключения перекрестного редактирования между различными локусами и достижения точного и безопасного мультиплексного нокаута генов исследователи разработали 10 ортогональных систем TKO, позволяющих эффективно одновременно нокаутировать до 10 генов. В отличие от мультиплексного редактирования с помощью Cas9, эффективность которого может снижаться из-за накопления внутрирамочных мутаций в нескольких мишенях, ортогональные системы TKO сохраняют высокую эффективность нокаута даже при одновременном редактировании нескольких генов или гомологичных копий генов.
Опираясь на TKO, исследователи затем разработали две интегрированные платформы генной инженерии, TRIM1 и TRIM2, сформировав единую платформу TRIM.
TRIM1 сочетает в себе TKO с модификацией последовательности на основе прайм-редактирования, что позволяет одновременно нокаутировать гены, заменять основания, вставлять, удалять, дублировать и инверсировать их в рамках единой системы редактирования. В регенерированных растениях риса T0 TRIM1 обеспечил одновременный нокаут одного гена и гомозиготное точное редактирование трех дополнительных целевых генов с эффективностью 22,8%.
TRIM2 включает в себя гибридный белок, состоящий из основного редактора и Cre-рекомбиназы, и позволяет осуществлять вставку, замену, удаление, инверсию ДНК в масштабах килобаз и хромосомную транслокацию посредством геномной инженерии с помощью рекомбиназы.
В отличие от существующих инструментов редактирования генома, которые обычно выполняют лишь ограниченное количество модификаций последовательности, TRIM объединяет нокаут генов, мелкомасштабное точное редактирование последовательности и крупномасштабную инженерию хромосом в единую платформу. Эта универсальная платформа предоставляет мощный способ быстрого объединения множества благоприятных аллелей, тем самым повышая точность селекции сложных признаков у однодольных культур.
Источник: Chinese Academy of Sciences. Автор: Лю Цзя.