К генетическим критериям систематики бактерий относятся: определение относительного содержания ГЦ-пар в ДНК; гибридизация нуклеиновых кислот; определение нуклеотидных последовательностей в молекулах ДНК или РНК, применение генетических зондов (ДНК-зондов), рестрикционный анализ ДНК; методы генетического анализа (изучение переноса генов, генетических скрещиваний, картирование хромосом бактерий).

Относительное содержание ГЦ-пар в ДНК

Относительное содержание ГЦ-пар в ДНК – это стабильный признак бактерий. Он не зависит от возраста, условий культивирования, отдельных перестроек генов в хромосоме. Данное свойство не изменяется под влиянием большинства мутаций. Эту величину рассматривают как один из важных признаков вида.

Молекулы ДНК разных микроорганизмов отличны друг от друга относительным содержанием пуриновых и пиримидовых оснований, формирующих комплементарные пары или ГЦ-пары в антипараллельных цепях ДНК.

Близкородственные микроорганизмы имеют идентичное или сходное содержание ГЦ-пар в ДНК. Далеко отстоящие в генетическом отношении микроорганизмы, сильно отличаются по относительному содержанию этих азотистых оснований.

Молекулярное содержание ГЦ-оснований у прокариот колеблется в широких пределах: от 25 до 80 мол %. Однако, у разных видов бактерий рода Pseudomonas, количество ГЦ-пар в ДНК характеризуется близкими величинами (61,8 – 69,5 мол % от общего количества оснований). То есть для каждого вида бактерий существует определенное среднее содержание ГЦ-пар.

Нуклеотидный состав ДНК бактерий определяют химическими и физическими методами. К химическим методам относят метод хемотографии на бумаге. К физическим – метод определения содержания азотистых оснований по температуре плавления ДНК и метод ультрацентрифугирования ДНК в градиенте плотности хлорида цезия.

Гибридизация нуклеиновых кислот

Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот – более тонкий метод оценки генетического сходства организмов. При помощи данного метода определяют число и степень сходства гомологичных участков в геномах сравниваемых видов. При помощи гибридизации нуклеиновых кислот впервые произведена количественная оценка родства микроорганизмов. В основе метода лежит способность одноцепочечных ДНК в определенных условиях соединяться с образованием двухцепочечных молекул ДНК.

При определении степени генетического родства данным методом ДНК, выделенную из клеток одного микроорганизма, денатурируют при помощи нагревания. Клетки второго штамма выращивают в среде, содержащей радиоактивный предшественник ДНК. В результате этого ДНК становится меченой. Из клеток меченого штамма выделяют ДНК, денатурируют и смешивают с денатурированной ДНК первого штамма. Раствор выдерживается при температуре ниже плавления ДНК. При этом происходит «отжиг» или реассоциация комплементарных цепей с образованием гибридных двухцепочечных молекул ДНК. Одноцепочечные молекулы удаляют.

Подобный эксперимент с препаратами ДНК неродственных бактерий, не выявляет ни какой гибридизации. Двойные спирали могут формироваться только при специфическом спаривании цепей, полученных из одной и той же молекулы ДНК.

Метод молекулярной гибридизации ДНК не всегда возможно использовать для изучения родственных связей между эволюционно далекими группами бактерий.

Методы генетического анализа

Перенос генетической информации и рекомбинации ее с ДНК реципиента может происходить только между родственными организмами. Межвидовому и межродовому переносу генов могут препятствовать внешние барьеры. Часто это различия в строении поверхностных структур клеток. Таким же препятствием служит и ферментативное расщепление «чужой» ДНК после ее проникновения в клетку. Образование генетических рекомбинатов служит более точным показателем уровня генетической гомологии, чем гибридизация in vitro. Это связано с тем, что включение каждого фрагмента молекулы ДНК донора зависит от степени его родства с ДНК реципиента именно в определенном, специфическом участке хромосомы, в котором и происходит (или не происходит) рекомбинация.

Метод молекулярных, или генных, зондов (ДНК-зондов)

Метод молекулярных, или генных, зондов (ДНК-зондов) – основан на реакции гибридизации между фрагментом нуклеотидной последовательности (зондом), несущим наиболее специфический и консервативный для данного вида бактерий ген, с ДНК изучаемого микроорганизма.

Этот метод позволяет идентифицировать любой биологический объект. Точность метода зависит от чистоты используемого зонда. Лучшими ДНК-зондами считаются полученные путем химического синтеза олигонуклеотидные последовательности с расположением нуклеотидов соответствующим подобному в участке гена (либо всего гена), отвечающего за определенную функцию бактерии.

Существуют различные способы метки ДНК-зондов: радиоизотопами, флуоресцентными красителями, биотином.

ДНК-полимеразная реакция (ПРЦ)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, при котором малые концентрации определенных фрагментов нуклеиновых кислот в биологической пробе многократно увеличиваются. Это позволяет точнее определить вид или другую систематическую категорию исследуемого биологического объекта.

Применение ДНК-полимеразной реакции позволяет значительно увеличить точность метода ДНК-зондов. В основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) лежит многократный процесс удвоения специфического участка нуклеотидной последовательности, ускоряемое по принципу катализа ДНК-зависимой ДНК-полимеразой, а так же применение соответствующего праймера.

Праймер – это фрагмент ДНК, несущий наиболее специфичную для данного микроорганизма нуклеотидную последовательность участка гена или гена в целом. С помощью праймера обнаруживают искомый фрагмент идентифицируемого микроорганизма.

Полимеразная цепная реакция (ПРЦ) используется для идентификации ДНК любого организма при наличии соответствующего праймера. Тест-системы с праймерами для проведения ПРЦ в целях обнаружения возбудителей различных заболеваний в последнее время широко внедряются в практику.

Определение нуклеотидных последовательностей (секвенирование)

Определение нуклеотидных последовательностей (секвенирование) – метод, позволяющий проводить сопоставительный анализ последовательностей в различных молекулах РНК и ДНК. Секвенирование всего генома бактерии – трудоемкая и дорогостоящая процедура. В этой связи чаще всего анализируются нуклетотидные последовательности рибосомных РНК– 16S-рРНК.

Установлено, что 16S-рРНК универсально распространена, функционально постоянна и достаточно консервативна. Чем больше различий в последовательности нуклеотидов данной РНК двух бактерий, тем раньше началось расхождение между ними и тем дальше отстоят они друг от друга в филогенетических отношениях.

(c) Справочник AgroXXI