Одну из первых микрографий вируса в 1939 году получили Г.А. Кауше и Е. Пфанкух при просмотре очищенных препаратов вируса табачной мозаики и Х-вируса картофеля. По мере совершенствования электронно-микроскопической техники расширялось и использование электронной микроскопии. В настоящее время данный метод широко применяется в фитовирусологии не только в качестве диагностического приема, но и при изучении биологии вирусов, особенностей их взаимоотношения с растениями и переносчиками, а также при определении концентрации вирионов.

Принцип работы электронного микроскопа

В устройство электронного микроскопа входит вольфрамовая нить, через которую проходит ток, нагревающий ее и вызывающий эмиссию электронов. Высокое отрицательное напряжение, прилагаемое к нити, обеспечивает значительную разность величины потенциалов между вольфрамовой нитью и заземленной пластиной анода.

Разность потенциалов приводит к ускорению движения электронов по направлению к аноду. При этом часть электронов проходит через отверстие в центре анода (центральную апертуру) и формирует электронный луч, направленный вниз по колонне микроскопа.

Данный луч фокусируется первой (конденсорной) магнитной линзой и освещает исследуемый препарат.

Основная масса электронов проходит через исследуемый объект без отклонения, но часть их подвергается рассеиванию тяжелыми атомами объекта и выбивается из общего электронного луча. Чем плотнее структура объекта, тем сильнее рассеивание лучей. В результате формируется структура выходящего луча, способная при повторной фокусировке преобразоваться в изображение исследуемого объекта.

Электроны, прошедшие сквозь объект, фокусируются второй магнитной линзой (объективной). Она и создает увеличенное изображение, которое увеличивается третьей (проекционной) магнитной линзой, а затем проецируется на экран с люминофорным покрытием.

Чаще всего вирусы фотографируют при увеличении в 20–50 тысяч раз. При печати фотографии есть возможность увеличить изображения ещё в несколько раз.

Требования к изучаемым биологическим объектам

Биологические объекты, предназначенные для изучения с помощью электронной микроскопии, должны отвечать следующим требованиям:

  • обладать высокой электрической проводимостью;
  • обладать устойчивостью к вакууму;
  • обладать устойчивостью к нагреванию;
  • обладать устойчивостью к действию электронного пучка;
  • обладать достаточно большими значениями атомных масс элементов, входящим в его состав;
  • быть выделенным из свежего материала.

Для четкой видимости вирионов под электронным микроскопом применяют контрастирование вирусных препаратов при их приготовлении – напыление металлом (хром, вольфрам, платина, золото) или негативное контрастирование при помощи химических соединений. Для негативного контрастирования используются фосфорно-вольфрамовая кислота, молибденовокислый аммоний, вольфрамат натрия. Негативное контрастирование обеспечивает возможность изучения внутренней структуры вирионов.

Методы приготовления вирусных препаратов

Вирусные препараты готовят на специализированных сетках диаметром 2–3 мм. Сверху сетки покрыты пленкой-подложкой из формвара или коллодия. Препараты для метода электронного микроскопирования готовят согласно специальным методикам.

  1. Метод погружения – пригоден для выявления нитевидных, палочковидных вирусов в ростках, листьях, кожуре клубней. Для этого край листа обрезают и место среза погружают на пару секунд в каплю дистиллированной воды, нанесенную на сетку с пленкой-подложкой. Таким же образом срезают кожуру клубня или росток (на высоте 1/3 клубня), место среза погружают в каплю дистиллированной воды на сетке. После высыхания капли препарат контрастируют металлом.
  2. Метод разбавленной суспензии – кусочек исследуемого листа (1 см2 или 10–30 мг) растирают в фарфоровой ступке до однородной массы и добавляют маленькими порциями 10–20 мг дистиллированной воды. Растирание продолжают до получения однородной разбавленной смеси. Каплю, полученной взвеси, наносят на сетку и после высыхания напыляют металлом. Метод применяется для исследования стабильных палочковидных и нитевидных вирусов, характеризующихся относительно высокой концентрацией вирионов в тканях растений.
  3. Препараты для лабильных вирусов (с нестойкими вирионами) готовят, используя с применением различных приемов, способствующих стабилизации вирусных частиц. Для таких вирусов, особенно с бацилловидной формой используют только негативное контрастирование. Для каждого вида лабильных вирусов разрабатываются индивидуальные способы контрастирования. В частности, вирус мозаики люцерны и вируса обыкновенной мозаики огурца сохраняют путем обработки очищенных препаратов формалином перед негативным контрастированием. Стабилизация вирионов вируса штриховатой мозаики пшеницы производится с помощью вакуум-инфильтрации внутрь тканей листьев 12% раствора глютаральдегида в течение получаса, затем суспензия негативно окрашивается фосфорно-вольфрамовой кислотой.

Иммуносорбентная электронная микроскопия

Иммуносорбентная электронная микроскопия является методом, сочетающий серологию с электронной микроскопией. Пленки-подложки обрабатывают специфическими антисыворотками. Это дает возможность выявить низкую концентрацию вирусов и дифференцировать вирусные частицы при смешанной инфекции.

При использовании данного метода сетку, пленкой вниз, помещают в каплю антисыворотки, обладающей специфичностью к данному вирусу. Через 30–40 секунд сыворотку удаляют фильтровальной бумагой, оставляя на пленке следы влаги. Затем сетку переносят на поверхность капли сока растения, затем на каплю контрастера. Избыточную жидкость удаляют фильтровальной бумагой.

При такой подготовке биологического материала под электронным микроскопом можно наблюдать вирусы, связанные и покрытые антителами диагностической сыворотки.

(c) Справочник AgroXXI