Культивирование зоовирусов производится в процессе изучения клинической картины и патогенеза вирусных заболеваний, при необходимости диагностики вирусных инфекций, для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

История

Впервые культивирование вируса бешенства осуществил В. Гальтье в 1879 году. Для этого кролик был заражен мозгом больной собаки. А. Левенштейн в 1919 году впервые опубликовал данные об успешной передаче вирусов герпеса к кролику от человека.

В. Грютер в 1920 году доказал, что вирус герпеса возможно культивировать на кроликах. Ф. Паркер и В.Н. Най в 1925 году доказали способность вируса коровьей оспы репродуцироваться в тканевой культуре. А.М. Вудрафф и Э. Гудпасчер продемонстрировали возможность культивирования зоовирусов, в частности, вируса оспы птиц, на хорионаллантоисной оболочке эмбрионов кур.

В 1954 году американские вирусологи Дж. Эндерс и Т. Уэллер получили Нобелевскую премию за разработку техники культивирования полиомиелита в тканевых культурах.

Технологии культивирования

Известно, что вирусы способны репродуцироваться только в живых клетках.

Установлено существование трех биологических систем в которых возможно культивирование вирусов вообще и зоовирусов в частности:

  • организм лабораторных животных;
  • развивающиеся куриные эмбрионы;
  • культуры клеток.

В целях заражения биологической системы конкретным видом вируса из исследуемого материала готовят суспензию. Для освобождения от посторонней микрофлоры (грибов и бактерий) в нее добавляют антибиотики. Готовый материал вводят в биологическую систему.

Лабораторные животные

В качестве лабораторных животных в вирусологических исследованиях используют белых крыс, белых мышей, морских свинок, золотистых хомячков, кроликов и другие виды.

Заражение животных вируссодержащим материалом проводится различными способами: внутримышечно, подкожно, внутривенно, интраназально и прочее. Способ заражения выбирается в зависимости от ткани, поражаемой данным видом вируса (тропизм вируса).

Репродукцию вируса в организме животного оценивают: по развитию видимых клинических симптомов или по патоморфологическим изменениям тканей и органов. Интенсивность репродукции вирусов показывают реакции гемагглютинации (РГА) с суспензией из органов, содержащих вирусы. Данная реакция основана на способности вирусов вызывать склеивание (агглютинацию) эритроцитов человека, птиц и млекопитающих при взаимодействии вирусных белков с рецепторами эритроцитов.

Развивающиеся куриные эмбрионы

Развивающиеся куриные эмбрионы (РКЭ) пригодные для вирусологических исследований имеют возраст 5–12 дней. Их использование дает возможность изготовить большое количество вируссодержащего материала и используется при производстве вакцин.

Заражения РКЭ производят различными способами:

  • на хорионаллантоиносную оболочку (ХАО);
  • на аллантоисную полость;
  • в амниотическую полость;
  • в желточный мешок;
  • в тело эмбриона.

Репродукцию вирусов устанавливают по гибели эмбриона, патологическим изменениям в оболочках и тканях, положительной реакции гемагглютинации (РГА). Гибель эмбриона определяют при прекращении его движения, выявляемое при овоскопировании (просвечивании).

Погибшие эмбрионы вскрывают. Извлекают их содержимое и проводят патологоанатомическое исследование. Эмбриональную жидкость смешивают с эритроцитами для определения гемагглютинации.

Культура клеток

Культура клеток является широко используемой биологической системой для культивирования вирусов. Ее получают из органов и тканей животных, птиц, человека. Клетки, полученные из разнообразных тканей и органов теплокровных животных, размножают вне организма в специальной лабораторной посуде на искусственных питательных средах.

Питательные среды, используемые для данной цели делят на:

  • ростовые – применяются для выращивания клеточных культур и обогащены сыворотками крови;
  • поддерживающие – применяются для сохранения монослоя клеток после заражения вирусами.

При выращивании клеточных культур соблюдаются требования строгой антисептики. Кроме того, используется посуда только из стекла нейтрального состава и сложные по составу питательные среды, содержащие минеральные соли, витамины, аминокислоты, глюкозу, сыворотку крови, буферные растворы. Для успешного выращивания клеточных структур в питательную среду добавляют антибиотики для подавления нежелательной микрофлоры. Оптимум температуры культивирования – + 36ºC–38,5ºC.

При заражении культур из сосудов с выросшим монослоем клеток удаляют остатки питательной среды. Затем монослой отмывают раствором Хенкса и вносят в него материал содержащий вирус. Спустя час – полтора остатки вируссодержащего материала удаляют, вносят поддерживающую питательную среду и инкубируют культуру в термостате.

Репродукцию культивируемых вирусов оценивают по следующим феноменам:

  1. Цитопатическому действию (ЦПД) или цитопатическомц эффекту (ЦПЭ) – патологические изменения морфологии клеток вплоть до их гибели.
  2. Образование внутриклеточных включений. Они могут быть локализованы в ядре и цитоплазме и представлять собой скопление вирусных частиц или отдельных компонентов вируса. Выявляются с помощью микроскрпирования.
  3. Образование бляшек или негативных колоний под агаровым покрытием. Бляшки являются участками разрушенных вирусами клеток в сплошном монослое. Они видны невооруженным глазом в форме светлых пятен на фоне окрашенного монослоя живых клеток. Каждая из них формируется потомством одного вириона. Бляшки, формируемые разными видами вирусов, различают по внешнему виду и срокам появления.
  4. Реакции гемадсорбции – способности культур клеток, инфицированных вирусом адсорбировать на своей поверхности эритроциты.
  5. Цветная реакция – изменение цвета индикатора, находящегося в питательной среде. Основана на том, что при отсутствии размножения вирусов, живые клетки в результате метаболизма выделяют кислые продукты, изменяющие цвет индикатора. При репродукции вируса метаболизм клеток нарушается. Они гибнут, и среда сохраняет первоначальный цвет индикатора.

(c) Справочник AgroXXI