Исследователи Массачусетского технологического института, MIT, планируют применить инновационную методику к формам рубиско, которые можно использовать в растениях для повышения скорости фотосинтеза, что потенциально может повысить урожайность.
«Я думаю, это убедительная демонстрация успешного улучшения ферментативных свойств рубиско, дающая большие надежды на разработку других форм рубиско», - говорит Мэтью Шоулдерс, профессор химии Массачусетского технологического института, выпускник 1942 года.
Шоулдерс и Роберт Уилсон, научный сотрудник кафедры химии, являются старшими авторами нового исследования, опубликованного в Трудах Национальной академии наук. Аспирантка Массачусетского технологического института Джули Макдональд является ведущим автором статьи.
Когда растения или фотосинтезирующие бактерии поглощают энергию солнца, они сначала преобразуют ее в молекулы, запасающие энергию, такие как аденозинтрифосфат. На следующем этапе фотосинтеза клетки используют эту энергию для преобразования молекулы, известной как рибулозобисфосфат, в глюкозу, что требует нескольких дополнительных реакций. Рубиско катализирует первую из этих реакций, известную как карбоксилирование. Во время этой реакции углерод из CO 2 добавляется к рибулозобисфосфату.
По сравнению с другими ферментами, участвующими в фотосинтезе, рубиско очень медленный, катализируя только от одной до 10 реакций в секунду. Кроме того, рубиско может также взаимодействовать с кислородом, что приводит к конкурирующей реакции, которая включает кислород вместо углерода - процесс, который тратит часть энергии, поглощаемой из солнечного света.
«Для белковых инженеров это действительно привлекательный набор проблем, поскольку эти характеристики кажутся вещами, которые можно улучшить, внеся изменения в аминокислотную последовательность фермента», - говорит Макдональд.
Предыдущие исследования привели к улучшению стабильности и растворимости рубиско, что привело к небольшому повышению эффективности фермента. Большинство этих исследований использовали направленную эволюцию - метод, при котором природный белок случайным образом мутирует, а затем проверяется на появление новых желаемых свойств.
Этот процесс обычно осуществляется с использованием подверженной ошибкам ПЦР - метода, который сначала генерирует мутации in vitro (вне клетки), как правило, внося только одну или две мутации в целевой ген.
В прошлых исследованиях по рубиско эта библиотека мутаций затем была введена в бактерии, которые растут со скоростью, соответствующей активности рубиско, чтобы убрать ограничения в методе подверженной ошибкам ПЦР и в эффективности введения новых генов, снижающем общее количество мутаций, которые могут быть получены и проверены с использованием этого подхода. Ручной мутагенез и этапы отбора также добавляют больше времени к процессу.
Вместо этого команда MIT использовала более новую технику мутагенеза, которую ранее разработала Shoulders Lab, под названием MutaT7. Эта техника позволяет исследователям проводить как мутагенез, так и скрининг в живых клетках, что значительно ускоряет процесс. Их техника также позволяет им мутировать целевой ген с более высокой скоростью.
«Наша технология непрерывной направленной эволюции позволяет рассмотреть гораздо больше мутаций в ферменте, чем это делалось раньше», - поясняет Макдональд.
Для этого исследования ученые начали с версии рубиско, выделенной из семейства полуанаэробных бактерий, известных как Gallionellaceae, одной из самых быстрых рубиско, обнаруженных в природе. Во время экспериментов по направленной эволюции, которые проводились на E. coli, ученые содержали микробы в среде с атмосферным уровнем кислорода, создавая эволюционное давление для адаптации к кислороду.
После шести раундов направленной эволюции исследователи выявили три различные мутации, которые повысили устойчивость рубиско к кислороду. Каждая из этих мутаций расположена вблизи активного центра фермента (где он осуществляет карбоксилирование или оксигенацию). Исследователи полагают, что эти мутации улучшают способность фермента предпочтительно взаимодействовать с углекислым газом, а не с кислородом, что приводит к общему повышению эффективности карбоксилирования.
«Основной вопрос здесь: можно ли изменить и улучшить кинетические свойства рубиско, чтобы он лучше работал в тех средах, где вы хотите, чтобы он работал лучше? Изменилось в процессе направленной эволюции то, что рубиско начал меньше реагировать с кислородом. То есть этот рубиско может хорошо функционировать в среде, богатой кислородом, где обычно он постоянно реагирует с кислородом, чего вы не хотите», - объясняет Шоулдерс.
В текущей работе исследователи применяют этот подход к другим формам рубиско, включая рубиско из растений. Считается, что растения теряют около 30% энергии солнечного света, который они поглощают, через процесс, называемый фотодыхание, который происходит, когда рубиско реагирует на кислород вместо углекислого газа.
«Это действительно открывает дверь для множества новых захватывающих исследований, и это шаг за пределы типов инженерии, которые доминировали в рубиско-инженерии в прошлом. Есть определенные преимущества для сельскохозяйственной производительности, которые можно было бы использовать с помощью лучшего рубиско», заключает Уилсон.
Источник: Massachusetts Institute of Technology. Автор: Энн Трафтон.
