Он поможет избежать отравления ФОС

Антидот к фосфорорганическим инсектицидам, способный заменить известное противоядие атропин, разработали в лаборатории биокатализа Института биоорганической химии им. Академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

(ИБХ РАН). В основе технологии — получение рекомбинантных белков в клетках млекопитающего. По продуктивности и стоимости технология ИБХ РАНвыигрывает у других разработок, что позволяет говорить о возможности промышленного выпуска антидота, информирует ria-ami.ru.

В 1936 году немецкий химик Герхард Шрадер, занимавшийся разработкой инсектицидов на основе фосфорорганических соединений, синтезировал новое вещество, которое уничтожало насекомых, поражая их нервную систему. Оно получило название «Табун». Случайно пролив каплю этого вещества, ученый обнаружил, что Табун отравляет и людей. Подчиняясь действовавшим в Германии законам, он доложил о своем открытии в отдел химического оружия Управления вооружений сухопутных сил в Берлине и дальнейшую работу с нервнопаралитическими отравляющими веществами продолжал уже в закрытых лабораториях. С тех пор на основе фосфорорганических токсинов (ФОТ) ученые разных стран разрабатывали все более эффективные яды для военного и сельскохозяйственного применения и параллельно искали к ним антидоты.
Денис Илюшин: «Мне хотелось бы в качестве финальной точки проекта увидеть медицинский препарат, участвовать в его промышленном производстве. Я надеюсь, что результаты этой работы не пригодятся; ведь в противном случае это означает, что кто-то отравился»

В 1997 году вступила в силу Конвенция о запрещении химического оружия, но проблему отравлений это не решило — фосфорорганические токсины продолжают использовать в качестве инсектицидов. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), бытовое летальное отравление ФОТ получают более 300 тыс. человек в год. Эффективное и безопасное противоядие к этим токсинам пытаются разрабатывать во многих лабораториях мира, одна из них — лаборатория биокатализа ИБХ РАН — близка к успешному решению задачи.

До этого было известно, как фосфорорганические токсины действуют на организм. «ФОТ связываются с ферментом ацетилхолинэстеразой и выводят из строя этот критически важный элемент механизма передачи нервного сигнала, тем самым блокируя сигнал на дыхательные мышцы, — поясняет научный сотрудник лаборатории биокатализа ИБХ РАН Денис Илюшин. — Поэтому в первую очередь при отравлении происходит остановка дыхания».

Противоядие для этих токсинов давно создано — атропин. Он тоже ядовит и тоже «отключает» ацетилхолинэстеразу, но в отличие от ФОТ его действие обратимо. Попав в кровь, молекулы атропина начинают конкурировать с молекулами ФОТ за связывание с ацетилхолинэстеразой. Это дает медикам время на выведение молекул ФОТ и их нейтрализацию. Со временем действие атропина прекращается, и нейроны восстанавливают свою работу. Главная проблема такой терапии в том, что она чревата нежелательными последствиями: от головокружения и усталости вплоть до летального исхода при острых отравлениях ФОТ. Получается, что атропин по сравнению с ФОТ — это лишь меньшее из двух зол, которое к тому же может оказаться несвоевременным.

Недавние исследования на специально выведенных мышах, геном которых не содержит гена, ответственного за синтез бутирилхолинэстеразы (БуХЭ), показали, что при отравлении фосфорорганическими токсинами такие грызуны гораздо более уязвимы, чем их собратья, организм которых вырабатывает БуХЭ.

«Этот факт свидетельствует о том, что БуХЭ является естественным антидотом, который из-за своего сходства с ацетилхолинэстеразой “вызывает огонь на себя” при отравлении ФОТ», — заключает Денис Илюшин. — Однако при отравлении пестицидами или боевыми отравляющими веществами обычного количества БуХЭ в организме оказывается недостаточно».

Самый простой способ получить БуХЭ — выделить ее из плазмы крови человека. На сегодняшний день разработан протокол промышленной очистки фермента из просроченной плазмы, которую уже нельзя использовать для переливания. По расчетам ученых, для эффективного связывания пяти отравляющих доз Зарина (отравляющее вещество) в течение минуты — именно за такое время сердце успевает прокачать весь объем крови в организме человека — нужно примерно 200 мг БуХЭ. Для получения этой дозы требуется переработать от 200 до 500 л плазмы. Таким образом, для наработки небольшого запаса препарата в тысячу доз потребовалось бы переработать весь годовой запас крови, например, в США. А если бы препарат вышел на рынок, цена одной дозы составила бы около 15 тыс. долл. Кроме того, всегда существует вероятность, что при очистке из плазмы в препарате останется возбудитель какого-нибудь заболевания, например вирус ВИЧ. Поэтому сегодня внимание ученых направлено на поиск других источников бутирилхолинэстеразы.

Современные методы биотехнологии, молекулярной биологии и генной инженерии позволяют получать практически любой белок человека, используя другие организмы. Для этого ген требуемого белка переносят в геном другой клетки. Полученные таким способом белки называют рекомбинантными.

Попытки получить рекомбинантную БуХЭ в клетках бактерий и дрожжей не дали результата. Выделять фермент из молока трансгенных коз (а такие попытки были) оказалось нерентабельно. БуХЭ из клеток растения табака не одобрило Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США, что, по сути, закрыло дорогу этому способу во всем мире.

Сравнение современных биотехнологических методов получения бутирилхолинэстеразы человека

Большие надежды ученые возлагают на получение рекомбинантных белков в культуре животных, в частности в раковых клетках яичников китайского хомячка (линия CHO). Эти клетки уже использовали для получения БуХЭ, но их продуктивность оказалась низка: всего 2—5 мг/л ростовой среды, в то время как для рентабельного производства необходим выход не менее 30—50 мг. Сотрудники лаборатории биокатализа ИБХ решили улучшить этот метод.

Исследователям удалось получить и клонировать клетку линии СНО с достаточно высоким выходом искомого фермента, а также добиться уровня экспрессии активного белка до 40 мг/л ростовой среды. Успех омрачал тот факт, что полученный клон производил БуХЭ в основном в форме одиночного мономера, в то время как молекула «естественной» БуХЭ в нашей крови состоит из связанных между собой четырех мономеров.

Время полувыведения полученного препарата из кровотока при внутривенной инъекции составило бы не более получаса. «Поскольку нашей целью в первую очередь является профилактика отравлений ФОТ, препарат с таким временем полувыведения нас явно не устраивал», — поясняет Денис.

Модель тетрамера бутирилхолинэстеразы человека, вид сверху. Стрелкой отмечен связывающий мономеры пептид

Скорость выведения фермента из крови во многом зависит от молекулярного веса белковой молекулы. Чем больше белок, тем хуже он будет фильтроваться в почках и тем дольше оставаться в организме. Чтобы увеличить размер молекулы рекомбинантного фермента, ученые совместили два подхода. Они модифицировали культуру клеток так, чтобы вместе с БуХЭ она производила пептид, «склеивающий» мономеры фермента в тетрамеры. Время полувыведения рекомбинантной БуХЭ из крови при этом увеличилось до трех часов.

Кроме того, исследователи химически изменили молекулы БуХЭ с помощью полисиалирования — новой и относительной дешевой технологии, ранее успешно отработанной на инсулине. Период полувыведения модифицированного таким образом фермента составил уже 16 часов, столько же удерживается в крови БуХЭ из плазмы крови человека.

Чтобы проверить, как действует полученный фермент, ученые провели испытания, в ходе которых мышам внутривенно вводили или полисиалированную БуХЭ, или БуХЭ из плазмы крови человека. Спустя полчаса мышей подвергали действию высоких доз ФОТ. В качестве токсина было использовано одно из самых опасных боевых нервнопаралитических веществ – агент VX (Ви-Экс — фосфороорганическое боевое отравляющее вещество нервнопаралитического действия). Результаты показали, что разработанный учеными препарат БуХЭ не менее эффективен для профилактики отравлений ФОТ, чем БуХЭ плазмы крови. В настоящее время сотрудники лаборатории готовят научные публикации по результатам своих исследований.

Иллюстрации предоставлены Денисом Илюшиным

Справочно. Получить отравление не так сложно: ФОТ, съеденные вместе с овощами и фруктами, которые были обработаны пестицидами, могут накапливаться в организме, откладываясь в жировой клетчатке. При резком сжигании жира в результате стресса, диет или активных упражнений токсины могут высвободиться в количестве, достаточном для отравления. Чтобы этого не произошло, овощи нужно ошпаривать, или мыть в слабом мыльном растворе, или хотя бы очищать от кожуры.

Исследования последних лет привели к формулированию концепции антидотов нового поколения — биологических антидотов (bioscavenger, от англ. scavenger – мусорщик, уборщик, чистильщик), не вызывающих осложнений. Одно из таких веществ — бутирилхолинэстераза крови человека (БуХЭ), близкая по своим свойствам к самой ацетилхолинэстеразе.